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負染的操作及注意事項

點擊次數:322 日期:2019/9/2 14:24:38

 負染的操作及注意事項
    滴染法:一般現將樣品用拉長的毛細吸管一滴在被膜的載網上,用濾紙在載網上吸去多余的樣品,使樣品在載網上僅有一層水膜而無液滴存在。在水膜未干時,再加一滴復染液在銅網上,然后用濾紙靠在載網變上吸去多余的染液,這是常規的負染方法。由于病毒在液滴的邊緣分布較多,上訴方法可能造成較多的病毒丟失,改良的方法是用毛細管在載網中部加1-1.5mm直徑的一小滴病毒懸液。不用濾紙吸干而任其在自然狀態下稍干后加入一小滴染液,也不用濾紙吸干,令其自然趕走。染液的密度取決于液滴的量和它的濃度,應經試驗確定,此法對于一些濃度低的病毒樣品可能獲得較好的效果。
 
漂浮法:現將需負染的樣品滴幾滴在干凈的載玻片上,再將有支持膜的載網漂浮在樣品液滴上以沾取樣品,用濾紙吸干樣品余液使樣品在載網上僅有一薄層液膜,在樣品未干時即加一滴復染液的銅網上,用濾紙吸干多余的染液即可。也可在磷鎢酸染液液滴中加入少許提純的病毒混勻,講有膜的銅網漂浮在液面上沾取有病毒的染液,用濾紙靠在銅網吸干。
 
噴霧法:將樣品與染液混合,用特制的噴霧器將混合液噴灑在有膜的載網上。這種方法的優點是樣品在載網上的分布十分均勻,但需要特殊的設備,故較少采用。而且染液和樣品消耗量較大,又易造成病毒的擴散。
負染的時機十分重要,一般不應再載網上的樣品完全干了之后,也不應該在載網上尚有肉眼可見的水珠時著手染色。應該在用濾紙吸干載網上的樣品液滴,肉眼看不見殘液,又未干燥時滴加染液。
提純的病毒在負染時最好進行1:10-1:100倍的稀釋,炫富病毒的緩沖液應盡可能稀一些,叫弄的緩沖液會使載網上產生許多鹽類的結晶而影響圖像的質量。緩沖液較濃時,宜先用雙爭輝稀釋。
復燃用的載網支持膜(有時是碳膜),有時因疏水性的影響沾樣后會形成一個球形液珠,用濾紙一吸即全部吸光,樣品難以附著在支持膜上,遇到這種情況,需要離子濺射儀對載網進行沁水處理,改善支持膜的親水性
復燃中常遇到顆粒懸滴樣品的凝集現象,即生物樣品與染色劑形成電子致密的團塊,致使無法觀察超微結構。這種現象是由多種因素引起的,除了上訴支持膜疏水性影響外,還可能是懸液濃度過大,懸液中細胞碎片過多,懸液PH值不適等,可以通過對樣品稀釋,驚醒2000-5000rpm離心和調節懸液PH值到中興或偏酸性來解決。
懸液顆粒分散性差也可以用分散劑來加以解決
用0.005-0.05%牛血清白蛋白(BSA)加入提純的病毒中,加入量無嚴格規定,一般0.5ml樣品中加3-4滴即可,如效果不好可適當怎額增加,也可直接用0.01%BSA作為離心沉淀物的懸浮液。
將桿菌肽粉末按30-50ug/ml的濃度用蒸餾水配成溶液,用來稀釋離心沉淀的顆粒標本或按適當比例加到需負染的樣品中取,也可以按樣品,磷鎢酸和桿菌肽等量混合在滴到載網上,吸干即可觀察。
除上訴兩種分散劑外,還有人采用甘油丙二醇作為分散劑,也有人用1%二甲基亞砜(DMSO)加到染液里加強染液的穿透力和擴散作用,最近有人用十八(碳)烷的單分子層作為濕潤劑,使不易染色的某些生物大恩自以著色。
某些病毒對復染色液較為敏感,負染色液會破壞形態結構,遇到這種情況,除改用其它種類的復染色液之外,還可在負染先用1%的戊二醛按比例與樣品懸液混合,固定15分鐘。或者在沾樣后,將載網票在0.1%的戊二醛液滴上進行固定。也可以用四氧化e整齊xun蒸固定然后在做負染。
滴樣后用雙蒸水進行適當清洗,可以有效地改善負染效果。尤其是使用醋酸鈾做負染色液時,應盡量洗掉樣品中的緩沖液鹽、組織汁液等,以免與負染液反應產生沉淀。經固定后的樣品必須經過清晰,對直接取自蔗糖密度梯度或氯化銫密度梯度離心沉淀帶的炫富樣品,沾取后雙蒸水適當清洗后,就可直接負染觀察。
觀察負染色的生物樣品時,電鏡應使用最小的武警光瀾,以增大反差。加速電壓可稍高一些,也增加電子的穿透能力。盡量避免電子束的長時間照射,一般在   3-4萬倍的放大倍率下照像,均可獲得高分辨率的電鏡圖像。
 

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